Isolasi Plasmid dan Elektroforesis

Posted by | Posted in genetika molekuler | Posted on 18-03-2011

Tujuan

Mengetahui cara mengisolasi plasmid untuk vektor kloning dan cara mendeteksi DNA dengan sel agarosa.

Pendahuluan

Bahan genetik utama jasad prokaryot pada umumnya terdiri satu unit molekul DNA untai ganda dengan struktur lingkar (circular). Pada bakteri Eschericia coli, bahan genetik utamanya terdiri atas sekitar 4.600 kb (4,6 x 106 bp). Selain bahan genetik utama, jasad prokaryot seringkali juga mempunyai bahan genetik tambahan yang disebut sebagai plasmid. Plasmid pada prokaryot berupa molekul DNA untai ganda dengan struktur lingkar. Pada umumnya plasmid tidak dibutuhkan oleh sel untuk pertumbuhan meskipun seringkali plasmid membawa gen-gen tertentu yang memberikan keuntungan bagi individu yang bersangkutan, misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik. Ukuran plasmid sangat bervariasi tetapi pada umumnya lebih kecil dari ukuran bahan genetik utama sel prokaryot, contoh plasmid CoIV-K30 yang ada dalam sel E. coli hanya berukuran sekitar 2 kb. Pada dasarnya plasmid merupakan entitas genetik yang diketemukan secara alami di dalam sel beberapa kelompok prokryot dan eukaryot. Dengan teknik rekayasa genetik,  sekarang telah dikembangkan plasmid artifisial dengan cara menggabungkan ge-gen dari plasmid alami maupun genom tertentu (Yuwono 2009).

Langkah pertama untuk memenuhi keperluan plasmid sebagai vektor dalam rekayasa genetika, maka dilakukan proses isolasi plasmid. Tahapan  pengendapan dalam isolasi plasmid adalah pemecahan sel, keluarnya plasmid dari nukleus dan pengendapan atau presipitasi plasmid. Isolasi plasmid ini memiliki banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sistemik maupun konservasi (Watson et al. 2008). Tahapan selanjutnya adalah elektroforesis, yaitu suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya dengan menggunakan medan listrik yang yang ada pada makromolekul misalnya DNA plasmid yang bermuatan negatif (Yuwono 2009).

Pembahasan

Proses isolasi diawali dengan mengkulturkan bakteri (menggunakan E. coli) selama semalam. Sentrifuge bertujuan untuk mengambil kulturnya dan menghilangkan mediumnya. Tahap selanjutnya adalah mentreatment kultur dengan pemberian larutan A, B, dan C. Semua larutan ini adalah lisis buffer. Komposisi larutan pertama adalah glukosa konsentrasi tinggi dan asam kuat (tris HCl). Seperti pada prinsip difusi osmosis, jika ada larutan yang konsentrasi tinggi masuk dalam sel, membran sel akan rusak. Pemberian larutan B terdiri atas NaOH dan SDS. NaOH bersifat alkali yang berfungsi merusak membran sel. Pada tahap ini, tidak ada proses memvorteks karena dapat merusak plasmid itu sendiri. SDS adalah sabun yang juga berfungsi menghancurkan membran sel (Sambrook et al. 1989). Hal ini dibuktikan pada saat tutup tube dibuka terlihat adanya lendi-lendir yang membuktikan bahwa membran sel telah lisis. Larutan C berguna untuk netralisasi yang dibuktikan dengan menggumpal dan menyatunya membran sel yang telah lisis sehingga supernatan (larutan bening berisi DNA) dapat diambil (Sambrook et al. 1989)

Larutan bening yang dicampur dengan PCl yang berfungsi untuk menghilangkan komponen-komponen lain dalam sel, misalnya protein. Sasaran yang ingin didapatkan adalah plasmid, sehingga larutan ditambah dengan etanol 100% dan NaOAc (buffer) karena DNA tidak larut dalam etanol maka akan didapatkan plasmid. NaOAc adalah garam buffer yang membantu proses pengendapan, sehingga proses ini dapat dinamakan etanol presipitasi, yaitu pengendapan plasmid dengan pemberian etanol (Sambrook et al. 1989). Pengendapan dipercepat dengan adanya proses inkubasi  yang dilanjutkan dengan sentrifuge dan dicuci dengan 70% dan pemberian TE. Melalui proses ini, plasmid harus bersih dari etanol karena jika tidak bersih maka plasmid tidak dapat larut. Akan tetapi, pada tahapan pemberian etanol 100 % yang berfungsi dalam proses pengendapan, terjadi kesalahan yaitu pemberian etanol 100 % diganti dengan etanol 70 %. Hal ini menyebabkan pengendapan tidak terjadi secara optimal. Selanjutnya dilakukan tahap purifikasi untuk mendapatkan plasmid  murni dengan menggunakan RNAse, sehingga RNA bisa dihilangkan.

Tahapan selanjutnya adalah elektroforesis  yang digunakan untuk menganalisis plasmid yang telah diisolasi untuk mengetahui ukuran dari plasmid. Ukuran plasmid ini dapat ditentukan dengan cara membuat gel agarosa. Agarosa ini merupakan suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam sautu buffer. Dalam keadaan panas, gel akan berupa cairan sehingga mudah dituang ke atas suatu lempeng yang biasanya terbuat dari Perspex (Yuwono 2009). Sebelum mendingin dan memadat, pada ujung gel tersebut dibuat lubang-lubang dengan menggunakan lembaran Perspex yang tipis yang menyerupai sisir.  Dengan demikian, pada waktu gel memadat dan sisirnya diambil terbentuklah lubang-lubang kecil. Gel agarosa yang terbentuk kemudian dimasukkan dalam suatu tanki yang berisi buffer dari TAE atau TBE. Plasmid dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel dengan larutan loading dye untuk menambah densitas plasmid. Etidium bromida digunakan untuk merendam plasmid sebelum divisualisasikan menggunakan sinar UV. Hasil pengamatan menunjukkan hanya DNA marker yang dapat tervisualisasi, sedangkan plasmid hasil isolasi dari praktikan tidak tervisualisasi. Hal ini dimungkinkan karena plasmid yang terisolasi terlalu sedikit sehingga tidak dapat ditentukan pergerakan molekulnya melalui elektroforesis.

Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa.  Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa).  Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa (Sambrook et al. 1989). Oleh karena itu, untuk elektroforesis DNA sering menggunakan media gel agarosa.

Kesimpulan

Percobaan ini meliputi isolasi plasmid dan memvisualisasikan dengan elektroforesis. Pada isolasi plasmid, terjadi kesalahan pada pemberian etanol 70% yang seharusnya etanol 100% sehingga pada saat elektroforesis plasmid tidak tervisualisasikan.

Daftar Pustaka

Sambrook J, Fritsch EF, Maniati T. 1989.  Molecular Cloning A Laboratory Manual. USA:  Cold Spring Harbor Lab Press.

Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. 2008.  Molecular Biology of The Gene. San Francisco: Pearson Education, Inc.

Yuwono T. 2009. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.

hari yang aneh…

Posted by | Posted in my diary | Posted on 02-03-2011

hari ini belum ada yang istimewa, tp aku yakin semuanya akan baik.

Asa hari ini

Posted by | Posted in penkom | Posted on 26-02-2011

semoga semuanya lancar,aaamiin…

Hello world!

Posted by | Posted in Uncategorized | Posted on 26-02-2011

Selamat datang di Blog Mahasiswa IPB. Ini adalah postingan pertamamu. Edit atau hapus postingan ini dan mulailah menulis blog sekarang juga!